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一、项目建设的意义和必要性

   1、国内外现状及技术发展趋势

   20世纪70年代以来，市场这只“看不见的手”使传统的工业文明达到了鼎盛时期。工业化在创造传统工业文明的同时，也对现代经济社会发展的生态基础造成了根本性的破坏，资源、环境和生态危机日益严重，其直接原因是18世纪以来造成人与自然尖锐对立的非持续的工业生产技术，其本质在于单纯的市场调节已无力减少技术发展的边际外部费用递增趋势。

   生物技术革命将促使有害生态环境的技术向无害化并能保护生态环境的方向发展，从而引起了社会生产技术体系的变化和飞跃。生物技术创新及其产业化，将为人类社会创造新的、更高水平的文明开辟了广阔的空间。运用生物工程技术，将使经济发展投入的资源少，利用率高，产出的产品或服务多，废弃物少，因此，人类将对生物工程技术产品的需求也将不断增加，生物技术在产业结构调整中的作用也将不断提高，生物工程技术创新将日益被重视，生物技术产品的市场将越来越广阔。

   生物酶制剂作为现代工业不可或缺的催化剂，主要技术一直为西方发达国家所垄断，尤其是高活力的纤维素酶，基因重组工程菌株一直被丹麦诺维信和美国杰能科等少数西方发达国家的企业所垄断，我国迄今为止尚无使用基因重组工程菌株进行产业化生产的企业。构建具有自主知识产权的基因重组纤维素酶工程菌株，生产高活力、热稳定性好的纤维素酶是目前我国酶制剂行业的发展方向，因此，国务院办公厅颁发《生物产业发展“十一五”规划》（国办发[2007]23号）明确强调支持纤维素酶和半纤维素酶基因工程菌株技术开发及产业化应用,也是国家科技部科技支撑计划“生物技术产品中试与规模化生产配套技术与工艺的研究与示范”重点支持项目。

   2、基因重组纤维素酶项目对相关产业发展的作用与影响

   2.1 提升酶制剂行业整体水平

   由于该项目是我国酶制剂行业******个采用具有自主知识产权的工程菌株进行产业化生产的项目，因此，对提高我国酶制剂行业和国外企业的竞争能力，提升行业整体水平具有积极意义。

   2.2 提高用户产品质量、降低生产成本

   采用该项目产品，对提高我国纺织行业、饲料行业、中药行业产品质量，降低生产成本，增强产品的市场竞争能力具有重要作用。

   3、该项目对关联产业的影响

   3.1 促进非粮燃料酒精尽快实现产业化,化解能源危机,保障粮食安全

   近年来，由于能源紧缺和技术手段的缺乏，我国不得不以粮食作为原料生产燃料酒精，但是由于保障粮食安全的需要，发展非粮燃料酒精是现阶段解决能源短缺的必由之路。秸秆燃料酒精的产业化生产，必须使用纤维素酶，因此，该项目的产业化是非粮燃料酒精产业化生产的关键因素之一，非粮燃料酒精的产业化对缓解能源危机、保障粮食安全具有重要的战略意义。

   3.2 推动农业产业结构的调整

   该项目生产的主要原材料是秸秆，由于原料在产地必须进行初发酵，因此，在农村将产生新的初发酵行业，同时，基因重组纤维素酶面市后，在农村还将产生以纤维素酶作为催化剂，生产秸秆糖化饲料的发酵企业。因此，该项目对地方农业产业结构调整，加快社会主义新农村建设，拉动农民致富，加快农村小康社会进程具有积极意义。

   3.3 推动地方经济的发展

   吉林市地处边疆近海省，自然环境优越，是我国更具魅力的城市之一，是福布斯排行榜评价朂适合发展工业的城市，是吉林省玉米，水稻的主要产区之一。但是，吉林市经济发展不平衡，缺少生物工程高新技术项目。引进生物工程高新技术企业，扶持地方农业产业化******项目是吉林市经济发展的重大举措之一，因此，该项目成为吉林市政府和吉林高新技术产业开发区重点招商引资项目。

   3.4 有利于资源再利用、发展循环经济、提高资源经济价值

  玉米及其它粮食秸秆多年以来一直作为废弃物或燃料，其经济价值几乎趋于零。基因重组纤维素酶项目采用的主要原料是玉米秸秆。这一资源是可再生资源，经过粗加工，每吨玉米秸秆价格可以达到600—900元，而制成纤维素酶，以粗加工的秸秆为基数，每吨秸秆产生的价值可提升十倍左右，提高了资源利用率，提升了资源的经济价值。

   4、市场分析

   该项目产品的主要应用领域为饲料、麻棉纺织、制药、生物发酵等行业，该项目产品是上述行业产品生产过程中不可或缺的添加剂。

   据不完全统计，国内市场纤维素酶年需求大约12万吨以上，05年至06年该类产品年需求增幅为38％；国际市场年需求大约40万吨，主要集中在欧美地区，占国际市场总消耗量的70％，而且需求量正在以每年8％的速度增长。此外，除燃料酒精行业外，用户直接使用的是复合酶，纤维素酶在复合酶中添加比例一般为80％左右，因此，纤维素酶市场需求量的统计一般以复合酶用量为依据。复合酶年用量统计如下（详见附件）：

   4.1 饲料行业：我国年产饲料1亿吨左右，按每吨饲料添加0.5公斤复合酶计算，年复合酶用量约为5万吨左右，其中纤维素酶添加量为4万吨左右。

   4.2 麻棉纺织行业：我国洗涤复合酶年用量2万吨左右，其中纤维素酶添加量为1.6万吨左右。

   4.3 啤酒行业：我国年产啤酒3500万吨左右，需大麦或小麦160万吨，按每吨添加1.5公斤计算，啤酒复合酶年用量2.4万吨左右，其中纤维素酶添加量为2万吨左右。

   4.4 燃料酒精行业：该行业为纤维素酶潜在的巨大市场。目前我国年产燃料酒精160万吨，预计2020年年产量将达到800—900万吨。纤维酶是生产非粮燃料酒精必须使用的催化剂，按每6吨原料生产1吨燃料酒精计算，预计2020年，秸秆等非粮原料年用量朂少4800万吨，纤维素酶投料比按每吨原料3‰计算，年需求量将达到14万吨左右。

   4.5 产品销售

   酶制剂生产厂家一般不直接面对终端用户，只面对销售代理商。因此，我公司现阶段只向相关代理商销售产品并已签订了意向协议，相关情况如下：

   国内销售：我公司已经和更大的销售商夏盛集团签订了意向销售合同，夏盛集团还出具了产品包销承诺书及该公司和用户签订的销售合同及供货计划。

   产品出口：我公司正在和杰能科公司、嘉吉公司进行接洽，公司经营副总曾任杰能科公司技术负责人，熟悉国外市场，产品出口前景广阔。

   5、与国家高技术产业化专项总体思路、原则、目标等关联情况

   该项目属于生物技术类，是国务院办公厅《生物产业发展“十一五”规划》（国办发[2007]23号）微生物技术专项重点支持项目；是国家科技部科技支撑计划“生物技术产品中试与规模化生产配套技术与工艺的研究与示范”重点支持项目；该项目2007年已经列入吉林省科技发展计划，分别被评为重大和重点项目并获得省长基金支持；该项目是地方农业产业化******项目，是国债资金重点支持的项目。

二、项目技术基础

   1、项目成果来源及知识产权情况

   1.1 某公司与中国科技大学易元生物技术有限公司合作，取得了基因重组纤维素酶原始菌株构建技术和菌株的使用权（详见附件《专利的专有技术使用合同》）。

   1.2 由某公司提供原始菌株、菌株构建技术及工艺方案，与吉林农业大学合作，取得了基因重组纤维素酶第二代工程菌株及菌株构建技术的所有权（详见附件《技术合同》）。

   2、已完成的研究开发工作及中试情况和鉴定年限

   2.1 本项目已完成基因重组纤维素酶工程菌株构建，该菌株现保存于吉林农业大学食品科学与工程学院实验室深冻冰箱中。

   2.2 2008年初已经在吉林农业大学完成了中试，中试结果与实验室试验结果一致（详见吉林农业大学生化实验室《检测报告》）。

   2.3 中试及小规模生产样品已交付用户使用，用户已出具使用报告（详见《宁夏夏盛果汁果酒酶有限公司传真函》）。

   2.4 某公司技术专家已经针对基因重组纤维素酶生产工艺条件开发了连续发酵等生产工艺。此外，公司技术专家有十年以上纤维素酶生产经验，已经掌握了成熟的纤维素酶生产工艺，因此，可以实现产业化生产。

   2.5 公司专家已经设计了纤维素酶系列产品生产线，主体设备及内部构件和管路连接已经完成。配套设备及GMP装饰工程完工后即可投入生产。

   2.6 必要的说明。纤维素酶工程菌株的构建采用的是国际前沿的生物工程技术及基因打靶技术，但是，酶制剂生产工艺是公知技术。此外，生产过程的发酵条件优于实验室条件，因此，只要中试设定条件与生产工艺条件一致，那么，所生产出来的产品性能将优于中试。

   3、技术或工艺特点以及与现有技术或工艺比较所具有的优势

   3.1 技术原理

   3.1.1 纤维素酶

   自然界中纤维素的降解需要内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作用。纤维素降解过程首先被外切纤维素酶的CBD吸附到不溶性纤维素表面，使结晶结构的纤维素长分子链开裂，聚集结构解聚，长链分子末端部分发生游离从而为纤维素水解酶类的作用提高了可及性和反应性，从而使纤维素易于水化；之后内切酶作用于经外切活化的纤维素，分解其β-1，4键，产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖。在内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1，4葡萄糖苷酶的协同作用下，纤维素的β-1，4糖苷键逐步水解，形成纤维寡糖和葡萄糖。其催化机理与溶菌酶相似，糖苷配基的脱去涉及2个保守羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂执行酸碱催化的双置换反应；谷氨酸位于细菌和真菌CBH，EG及葡萄糖苷酶的活性位点。协同作用其作用顺序不是******按各酶的功能也不是简单固定的。CBH和EG都能引起纤维素的分散和脱纤化，因此纤维素的结晶结构被打乱导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的纤维的微结晶，利于进一步降解。

   3.1.2 基因的同源重组技术

   基因的同源重组技术（homologous recombination），又称基因打靶（gene targeting），指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。

   根据重组后靶基因的特征可以分为两种类型：

   ①由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有结构被破坏，此即为基因破坏或剔除；                  

   ②靶基因的全部序列为新的基因所取代。这一新兴技术已被证明为目前能******的修饰基因组的朂有效方法，从理论上讲它将使人类能按设计对极其复杂的细胞基因组结构进行定点、定量的改变，从而定向的改变细胞的遗传结构和特征。

   同源重组技术的特点为：

   ①同源重组技术能把外源基因引入染色体DNA的特定片段上，在设计合理的情况下，同源重组技术可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造；

   ②同源重组后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制。

   3.2 技术特点或创新点

   3.2.1 本项目由于在CBH II上游加入不受葡萄糖抑制的真核启动子PKI A，使CBH II不再受到培养基中葡萄糖影响，获得高效表达，从而促进其他纤维素酶基因的协同表达，较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。

   3.2.2 几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中得到表达。但是这一体系表达率低，产生的酶多数不能分泌到胞外。本项目成果使纤维素酶在原木霉宿主菌中获得稳定高效表达，可以用于大规模培养及工业化生产。

   3.2.3 本项目对基因工程菌株的培养及产酶条件进行了摸索，尝试进行液体培养基深层发酵，通过分段控制pH值、温度和溶解氧进行发酵，发酵72小时左右酶活达到更高，为工业化大规模生产纤维素酶提供了参考。

   3.3 技术研制报告

   纤维素酶属诱导型酶类其多个酶组分的表达调控是一个非常复杂的过程，其中CBH II具有关键的作用。据报道( Seiboth et al.1997)，当CBH II基因缺失时，会影响纤维素酶系其它酶的表达，而缺失CBH I，EG III等基因时，只影响自身的表达。另有研究表明CBH II是木霉纤维素酶系统中更先表达的酶，其产物进一步诱导纤维素酶其他酶如CBH I，EG等酶基因的表达。而CBH II基因的表达又受到葡萄糖的抑制(Sternberg & Mandel，1979)，因此要提高木霉的纤维素酶的产酶能力就可以通过木霉CBH II基因克隆，将其构建在不受葡萄糖抑制的真核启动子下游如PKI，cDNA1等启动子，使CBH II不再受到培养基中葡萄糖影响而得到高效表达，从而促进其他纤维素酶基因的协同表达，较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。

   由于木霉菌属于半知菌，缺乏有性阶段，对其杂交育种有一定困难。原生质体育种是一种非常有效的方法，木霉的转化系统与其他真菌转化系统相似，多为使用细菌来源的质粒构建的载体，在聚乙二醇（PEG），山梨醇和氯化钙作用下把目的基因或DNA 片段引入受体原生质体，经过再生和选择获得转化子。选用一个稳定的选择标记对建立木霉转化系统是非常必要的，木霉转化的选择标记包括营养缺陷型标记和显性标记两类。前者常用的如PyrG 或Pyr-4，后者常用的有HmR，benA，和amds。

   本成果采用先进的分子生物学技术，构建成功高活力纤维素酶工程菌体，超过国内目前使用的生产菌体的产酶能力，达到了国际先进水平。

   3.3.1供试菌种  绿色木霉G104中国科学技术大学生命科学学院基因工程实验室保藏。

   3.3.2启动子选择  PKI A (0.4Kb)。

   3.3.3载体  pUT (9.2Kb) 中国科学技术大学生命科学学院基因工程实验室构建，包含Ben A显性标记。

   3.3.4培养基及培养条件  麦芽汁液体培养基pH 5.0，30℃，220r/min 培养24h。

   3.3.5试剂  pGEM-T-easy-vector Kit购自Promega 公司，Taq plus DNA polymerase       购自上海生工公司，限制性内切酶购自Promega 公司。

   3.3.6真菌总DNA 的提取

   ①离心收集菌体，加入400μl DNA 提取液(50mmol/L Tris-HCl，pH9.0；12.5mmol/L EDTA，pH8.0)；

   ②充分振荡后加入100μl 10%SDS及300μl氯化苄振荡混匀，50℃保温1h，每隔10min振荡一次；

   ③加入50μl 3mol/L醋酸钠，离心，收集上清，用异丙醇沉淀得到总DNA。

   3.3.7PCR扩增CBH II序列

   ①根据已知绿色木霉cDNA序列，设计PCR引物，由上海生工公司合成；

   ②PCR 扩增：用标准PCR反应体系进行PCR反应。

   PCR循环条件：预变性94℃3min，94℃ 变性50s，51℃ 复性50s，72℃ 延伸1min20s，35个循环后再延伸8min。

   3.3.8重组质粒载体pUT-CBH的构建

   ①用Gel extraction试剂盒从胶中回收PCR产物，得到约1.6Kb的CBH II片段，将其用Klenow酶补平后回收纯化。

   ②将pUT质粒载体在多克隆位点用EcoR I限制性内切酶消化，产生的3’粘性突出末端用Klenow酶补平并将其回收纯化，将上述两个片段以合适的比例建立反应体系，转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒载体pUT-CBH。对筛选到的重组质粒用内切酶和PCR进行鉴定分析，所扩增的片段含有完整的CBH II序列。

   3.3.9重组质粒载体pUT-CE的构建

   将pUT-CBH质粒载体在用EcoR V限制性内切酶消化，产生的3’粘性突出末端用Klenow酶补平并将其回收纯化，与PKI A片段以合适的比例建立反应体系，转化大肠杆菌DH5a，获得具有PKI A启动子的重组质粒载体pUT-CE。

   3.3.10 pUT-CE重组质粒的转化及重组菌的筛选

   将构建的重组质粒电转化宿主菌G104，利用Ben A显性标记进行初筛；而后进一步采用液体摇瓶培养检测发酵液复筛，获得一株表达量较高的重组菌，命名为G104-CE。

   3.3.11液体培养基深层发酵

   在10 L的通气机械搅拌发酵罐中，接种量为10%，发酵过程采取分段控制pH值、温度和溶解氧的工艺，发酵72h左右酶活力更高，实验室样品酶活力达到：液体3200u/ml。

   3.4 技术的先进性

   蛋白质基因同源重组技术是国家863计划项目，863计划项目在技术上均为************或先进技术。基因重组纤维素酶菌株构建是863计划蛋白质基因重组技术的延续。本项目采用的基因打靶技术是国际先进技术，纤维素酶的技术指标中热稳定性高于国外同类产品水平。

   3.5 产品的技术性能、生产成本、销售价格优势

   由于本项目在菌株改造上采用了世界先进的基因重组技术，所生产的纤维素酶在技术及其它方面具有以下优势：

   3.5.1 产品技术性能优势

   ******、高活力。诺威信公司的同类产品酶活为2800u／ml,该公司产品的发酵液活力可达3200u／ml；

   第二、热稳定性。美国杰能克公司产品的热稳定性在55℃以下，该公司产品的热稳定性可达85℃。

   3.5.2 生产成本优势

   据了解，国外厂家2万活力纤维素酶生产成本在12000元/吨以上，该公司的生产成本可控制在8000元／吨以下。

   3.5.4 价格优势

   国外同类产品市场售价为4.6万元/吨，可研及本报告中该公司产品出厂价为液态酶1.4万元/吨，固态酶1.5万元/吨。

   4、该重大关键技术的突破对行业技术进步的重要意义和作用

   4.1 提高酶制剂行业整体水平。该项目是我国******个采用有自主知识产权的基因重组工程菌株进行产业化生产的项目，对提升我国酶制剂行业总体水平，提高我国酶制剂行业和国外企业的竞争能力具有积极的意义。

   4.2 基因重组纤维素酶菌株构建技术的成熟将对耐高温糖化酶菌株构建及其它酶制剂的基因重组具有借鉴意义。

   4.3 采用具有自主知识产权的工程菌株进行产业化生产将对我国酶制剂行业的自主创新具有积极的示范作用。

三、项目建设方案

   1、建设规模

   根据吉林市的资源状况、自然环境和市场调查情况，结合生产实际情况、建厂条件、资金情况、原辅材料供应等各种因素，该项目纤维素酶生产规模确定为年产15000吨。

   2、建设的主要内容

 　　　　　来源：中经汇成（北京）城乡规划设计研究院－中国产业规划网